IT4IP核孔膜在誘導脂質(zhì)囊泡膜融合和細胞內遞送的應用研究

高分子聚合物薄膜經(jīng)高能重離子輻照后，在薄膜中沿入射離子路徑上會(huì )形成圓柱狀損傷區域，直徑約１０ｎｍ，這些損傷區域稱(chēng)作離子的潛徑跡，潛徑跡經(jīng)過(guò)化學(xué)蝕刻處理可形成中空通道（孔），即為核孔膜。相比于常規濾膜，IT4IP核孔膜擁有眾多優(yōu)點(diǎn)，如表面平整光滑、孔徑均一、圓柱形孔形（圖１－１），此外還具有機械強度高、過(guò)濾速度快和截留特性好等優(yōu)點(diǎn)。

核孔膜的生產(chǎn)工藝主要包括輻照、紫外敏化和蝕刻等三個(gè)主要步驟。輻照一般利用加速器或者反應堆進(jìn)行，目前主要都采用加速器進(jìn)行輻照。紫外敏化主要是改善核孔膜的孔形，讓錐度更小、透氣率更高、孔徑更均勻?；瘜W(xué)蝕刻則決定核孔膜最終孔徑大小

基于IT4IP核孔膜的特點(diǎn)，其應用已相當廣泛。目前，很多微生物檢測、癌細胞的檢測以及氣體的檢測都需要用到核孔膜截留取樣。在制藥工業(yè)，核孔膜主要用于藥用水的過(guò)濾及終端除菌過(guò)濾，血液制品的過(guò)濾，空氣與蒸汽的過(guò)濾等。在食品飲料行業(yè)，核孔膜用于酒類(lèi)、飲用水、奶制品、茶飲料等的澄清和除菌過(guò)濾，可代替離心法用于分離，或代替熱處理法用于除菌。在電子工業(yè)，可用于制備光刻膠及環(huán)境氣體凈化，以提高電子產(chǎn)品的質(zhì)量和成品率。在化工業(yè)，IT4IP核孔膜用于制備超純試劑及溶劑中貴重的懸浮物和觸媒的回收等。此外，在藥用及化妝品用脂質(zhì)體制劑的研發(fā)和生產(chǎn)中，基于核孔膜的擠出法是脂質(zhì)體粒徑均一化及降低粒徑的方法之一。

本文基于IT4IP核孔膜的擠出法進(jìn)行了兩部分研宄，一是擠出法誘導脂質(zhì)囊泡膜融合并構建雜化外泌體，二是基于擠出法的細胞內遞送研究。主要內容及結果如下：

１、擠出法誘導熒光標記脂質(zhì)體與空白脂質(zhì)體發(fā)生膜融合。采用熒光共振能量轉移法對膜融合過(guò)程進(jìn)行了定性和定量分析，并檢測了膜融合前后脂質(zhì)體粒徑的變化，以?xún)鋈诜ㄗ鳛閷φ?。結果顯示，經(jīng)過(guò)擠出處理，焚光標記脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體發(fā)生了膜融合，也即熒光標記磷脂轉移到空白脂質(zhì)體，膜融合效率與凍融法相當，且耗時(shí)較短。相比凍融法，所制得的膜融合脂質(zhì)體粒徑均一。

２、擠出法可誘導熒光標記脂質(zhì)體和外泌體發(fā)生膜融合，即構建雜化外泌體。首先用透射電鏡對從Ｋ５６２培養上清提取的外泌體進(jìn)行了鑒定，然后利用擠出法誘導熒光標記脂質(zhì)體與外泌體發(fā)生膜融合，熒光共振能量轉移法對膜融合過(guò)程進(jìn)行了定性和定量分析，并檢測了膜融合前后脂質(zhì)囊泡粒徑的變化，以?xún)鋈诜ㄗ鳛閷φ?。結果顯示，經(jīng)過(guò)擠出處理，焚光標記脂質(zhì)體和外泌體發(fā)生了膜融合，但透射電鏡下雜化外泌體仍然保持了典型的茶托結構。擠出法的膜融合效率稍低于凍融法，但其具有耗時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)。此外，擠出法制備的雜化外泌體具有較均勻的粒徑，而凍融法構建的雜化外泌體則粒徑及粒徑分布范圍都變大。

３、基于IT4IP核孔膜的擠出法可通過(guò)誘導ＣＴ２６細胞變形及細胞膜短暫穿孔而將介質(zhì)中各種大分子遞送進(jìn)入細胞，經(jīng)擠出處理的ＣＴ２６細胞仍可正常貼壁生長(cháng)及增殖。膜孔徑和遞送材料的分子量是影響遞送效率的重要因素。不同分子量右旋糖酐經(jīng)擠出遞送后，在細胞漿和細胞核都有分布，但是質(zhì)核比與分子量呈正相關(guān)。

４、基于IT4IP核孔膜的擠出法可通過(guò)誘導Ｋ５６２細胞變形及細胞膜短暫穿孔而將介質(zhì)中各種大分子遞送進(jìn)入細胞，經(jīng)擠出處理的Ｋ５６２細胞任可正常生長(cháng)及增殖。膜孔徑和遞送材料分子量是影響遞送效率的重要因素。此外，不同分子量的右旋糖酐經(jīng)擠出遞送后，在細胞漿和細胞核都有分布，水合半徑大于核膜復合體被動(dòng)擴散尺度上限的２ＭＤａ右旋糖酐主要在擠出處理后起初的１小時(shí)內進(jìn)入細胞核，這強烈提示擠出處理誘導了核膜破裂，從而允許其進(jìn)入細胞核。